NK細胞無需抗原預先緻敏，即可(kě)快速反應并同時激活免疫系統來協同發揮殺傷作(zuò)用(yòng)，堪稱免疫細胞裏的航空母艦。科(kē)學(xué)家對NK細胞療法也寄予厚望，全球的NK細胞相關療法也在如火如荼的進行着。如何高效利用(yòng)NK細胞幫助我們戰勝疾病，科(kē)學(xué)家們為(wèi)此一直在努力着，而提高NK細胞的純度，便得以達到更好的治療效果。
Fig1：NK 細胞的來源
細胞療法在臨床腫瘤治療上的颠覆性成功顯示其巨大的潛力。而NK細胞是殺傷腫瘤細胞的重要效應因子，随着科(kē)學(xué)家的不斷探索和研究，它的應用(yòng)也越來越受到關注。由于NK細胞不受MHC限制，故其不會引起移植物(wù)抗宿主病的優點被廣受青睐。再者由iPSC分(fēn)化而來NK細胞還可(kě)以實現批量化生産(chǎn)，提高生産(chǎn)效率。這使得NK細胞成為(wèi)開發“現貨型免疫療法”的高潛力細胞。
技(jì )術與産(chǎn)品持續創新(xīn)與突破
在對NK細胞不斷的探索中(zhōng)，細胞的表型和功能(néng)鑒定是不可(kě)或缺的關鍵步驟。譬如，獲取足夠數量、高純度且高活力的NK細胞是保證治療效果的關鍵，2023年3月1日，上海吉濤生物(wù)科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司針對NK細胞的純度進行差異化創新(xīn)産(chǎn)品,截止2024年1月12日,其純度可(kě)達到99%。培養詳細進程如下:
細胞培養
培養室驗室外部照片實拍：
培養過程的照片：
圖片标注：NK細胞培養的第三天，顯微鏡下的細胞生長(cháng)分(fēn)布，密度情況。
NK近99%純度報告：
圖片标注：通過第三方流式檢測後的報告，NK細胞标志(zhì)物(wù)CD3-CD56+顯示達到了97.41%。
關于提純和培養：
提取PBMC
NK細胞的培養是從人體(tǐ)的外周血單個核細胞PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）開始的，而PBMC需要從健康人的血液中(zhōng)盡快進行處理(lǐ)并分(fēn)離提取。采血使用(yòng)的是肝素鈉采血管，我們需取約40-50ml血液進行一份NK細胞的培養，也會按獻血人的年齡、身體(tǐ)情況等不同有(yǒu)區(qū)别，一般在采血後送達實驗室，實驗室便進行處理(lǐ)。臍血CBMC（Cord Blood Mononuclear Cell）可(kě)通過采血袋進行采集。我們處理(lǐ)血液分(fēn)離細胞使用(yòng)的是Ficoll®梯度離心分(fēn)離法，另外滅活并保存血漿。
培養概述
本實驗室通過接近17天的培養流程将約5kw的PBMC培養成1m/ml的NK細胞約2600ml。全程使用(yòng)的是進口培養基、試劑，進口耗材。在PBMC分(fēn)離後，用(yòng)生理(lǐ)鹽水重懸，取少量細胞進行計數，使用(yòng)約3*10^7 - 5*10^7進行以下處理(lǐ)。如有(yǒu)剩餘可(kě)另行凍存。
制備使用(yòng)的培養基。培養細胞時培養基的選擇至關重要，我們采用(yòng)的是進口的無血清免疫細胞培養基，裏面包含的營養成分(fēn)足夠在正常培養條件下促進細胞生長(cháng)與擴增。細胞培養基中(zhōng)加入的刺激劑可(kě)誘導NK細胞的增值與分(fēn)化。同時我們所添加的試劑因子可(kě)提高NK細胞的殺傷作(zuò)用(yòng)和活性。
取在培養步驟用(yòng)包被液包被并保存在4°24h的T75瓶，棄包被液，用(yòng)9ml加入了激活的培養基重懸細胞，1ml自體(tǐ)滅活血漿和保密試劑，放入培養箱37，5%CO2濃度培養。之後隔天觀察，并在細胞處于可(kě)處理(lǐ)的狀态時，及達到理(lǐ)想的擴增密度約為(wèi)1-2*10^6/ml時，可(kě)加液補充。
培養過程中(zhōng)，當液體(tǐ)體(tǐ)積與密度到達可(kě)換T175瓶時從原本的T75瓶内轉出，再正常培養；之後在液體(tǐ)體(tǐ)積到達可(kě)換培養袋時将細胞及液體(tǐ)轉入。
在Day18左右，NK細胞達到理(lǐ)想的數量時（可(kě)取少量細胞懸液進行計數）可(kě)進行離心收集，并檢測細胞懸液NK細胞含量成分(fēn)及純度。
上圖報告為(wèi)2023年3月的一次NK細胞培養Day18時送至第三方流式檢測形成的細胞類型分(fēn)布。本案例中(zhōng)我們可(kě)以看到NK細胞标記物(wù)CD3-CD56+（97.41%），達到了近99%的培養水平。時至今日,除了NK細胞的制備,TILs細胞在此基礎上更進行叠代更新(xīn),新(xīn)的數據顯示tils現可(kě)制備1200億-2400億, 再創新(xīn)高。
據吉濤生物(wù)創始人劉天津介紹，TIL療法已在治療宮頸癌、子宮内膜癌、黑色素瘤、膽管細胞癌、卵巢癌、胰腺癌等臨床試驗中(zhōng)取得令人可(kě)喜的療效數據。TIL療法是一個适應症覆蓋面非常廣的療法，對于多(duō)種類型的實體(tǐ)腫瘤都能(néng)産(chǎn)生不錯療效。而吉濤生物(wù)新(xīn)型的DC-TIL療法将突破傳統制備上的細胞數量,利用(yòng)新(xīn)型誘導技(jì )術和激活方式讓戰鬥的細胞數值達到2400億單位量。
TIL療法治療實體(tǐ)瘤
TIL療法在實體(tǐ)瘤中(zhōng)取得的療效基于其具(jù)有(yǒu)優勢：
靶向性強：來自于腫瘤組織的TIL主要由效應記憶T細胞(Tem)組成，表面表達的趨化因子受體(tǐ)(如CCR5、CXCR3)聯合多(duō)種腫瘤特異性TCR，在TIL輸注後，可(kě)以準确靶向腫瘤新(xīn)生抗原；
腫瘤浸潤能(néng)力強：TIL細胞來自腫瘤，腫瘤趨化因子受體(tǐ)高表達，合适的趨化因子受體(tǐ)系統，使得TIL回輸後可(kě)更好地浸潤腫瘤組織；
安(ān)全窗口高：天然TCR識别，耐受高達10E11級的回輸劑量，安(ān)全窗口非常寬，僅識别腫瘤細胞抗原，不會靶向自身正常細胞，臨床上顯示良好的安(ān)全性；
療效持久：TIL細胞中(zhōng)記憶性T細胞比例高，是非選擇的腫瘤特異性殺傷T細胞，靶向多(duō)種抗原，可(kě)克服因靶點丢失引起的複發問題。2012年接受TIL療法的幸存者Melinda，目前已成功存活11年。
技(jì )術創新(xīn)對突破TIL療法 技(jì )術壁壘極為(wèi)重要
吉濤生物(wù)的科(kē)學(xué)家們為(wèi)了在魚龍混雜的體(tǐ)系之中(zhōng)提純出NK細胞進行了數十年的研究，但各種方法都存在自己的優越性以及局限性，這就需要我們學(xué)會理(lǐ)性分(fēn)析自己的需求特點，選擇合适的提純方案，并在實踐中(zhōng)不斷優化和改進技(jì )術。我國(guó)的NK細胞療法起步雖然略慢，但是我們充分(fēn)利用(yòng)了産(chǎn)業模式以及廣納新(xīn)的科(kē)學(xué)技(jì )術，發展出許多(duō)NK細胞提純的平台，為(wèi)我國(guó)NK細胞相關研究和應用(yòng)保駕護航。在疫情陰霾完全散去的今天，我國(guó)的免疫治療領域正如NK細胞本身一樣，在監管反應和協同方面同時發力，為(wèi)戰勝疾病貢獻自己的力量。
