近年來，通過人體(tǐ)自身免疫系統抵抗腫瘤的免疫療法為(wèi)腫瘤幹預的發展拓展了更多(duō)可(kě)能(néng)性。相對于手術、放療、化療等幹預方式，免疫療法的副作(zuò)用(yòng)相對較小(xiǎo)，也對一些其他(tā)療法不起作(zuò)用(yòng)的情況有(yǒu)不錯的療效。但由于目前的免疫療法主要包括免疫檢查點單克隆抗體(tǐ)幹預、過繼性免疫細胞幹預、人重組細胞因子（非特異性免疫療法）、溶瘤病菌療法和腫瘤疫苗幹預幾個方面，然而這些療法在臨床應用(yòng)上仍然面臨各種限制，并非萬無一失，腫瘤細胞仍然有(yǒu)逃脫免疫細胞“檢查”的可(kě)能(néng)性，因此急需開發新(xīn)類型的腫瘤免疫療法。
近期，耶魯大學(xué)研究團隊将其關于幹預腫瘤的一項新(xīn)的免疫療法結果發布于《Nature Immunology》期刊上。這篇名(míng)為(wèi)“Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity”的文(wén)章中(zhōng)所展現的結果表明，基于CRISPR激活（CRISPRa）平台的多(duō)重激活内源基因免疫療法（MAEGI，Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy）可(kě)靶向特定類型的癌細胞并激活相關基因表達，通過準确定位、标記并放大信号，使免疫系統攻擊标記的癌細胞，可(kě)有(yǒu)效殺傷或消除小(xiǎo)鼠體(tǐ)内多(duō)種類型的腫瘤。這種幹預方式通過改變腫瘤微環境，并以增強T細胞浸潤和抗腫瘤免疫為(wèi)特征。多(duō)路内源性基因激活是一種多(duō)用(yòng)途的、高度可(kě)伸縮的策略，以引發針對腫瘤的有(yǒu)效免疫反應，有(yǒu)别于其他(tā)的腫瘤療法。這項研究有(yǒu)望幫助人類的免疫系統識别、攻擊并除掉癌細胞。
通過CRISPRa激活癌細胞的多(duō)重内源基因的表達進而增強潛在的抗腫瘤免疫反應
首先，研究人員用(yòng)腺相關病菌來遞送CRISPRa文(wén)庫到腫瘤内部并準确靶向腫瘤的突變基因。研究表明通過CRISPRa慢病菌載體(tǐ)轉染三陰性乳岩癌細胞E0771 ，使得細胞同時表達dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1，并進而利用(yòng)磷酸甘油酸脂激酶PGK基因的啓動子激活OVA蛋白的表達從而得到E0071-OVA穩轉細胞系，并與分(fēn)離出來的經OVA體(tǐ)内活化的CD8+ T細胞進行共培養，來評估此腫瘤免疫療法的有(yǒu)效性。TAAs(腫瘤相關抗原)低表達的腫瘤細胞經CRISPRa激活後可(kě)在細胞膜表面高表達TAAs，并被免疫系統的CD8+ T細胞識别和殺傷。
CRISPRa激活并上調腫瘤細胞相關基因的表達以增強其免疫原性
在上述的模式研究模型的基礎上，研究人員将MAEGI療法拓展到了小(xiǎo)鼠身上，并借助AAV-CRISPR體(tǐ)系遞送sgRNA文(wén)庫到C57BL/6J小(xiǎo)鼠的TNBC腫瘤内部，結果發現相比PBS處理(lǐ)組和空載質(zhì)粒組，導入AAV-g-MAEGI小(xiǎo)鼠的腫瘤生長(cháng)受到了顯著的阻礙，于此同時ELISA實驗也證明AAV-g-MAEGI組小(xiǎo)鼠有(yǒu)着更多(duō)IFNγ的産(chǎn)生和更多(duō)數目的CD8+ T細胞。以上結果也表明，通過MAEGI療法，小(xiǎo)鼠體(tǐ)内的抗腫瘤免疫性得到了顯著增強。
小(xiǎo)鼠體(tǐ)内評估MAEGI療法的有(yǒu)效性
研究者借助單細胞測序技(jì )術，在細胞水平進一步驗證了活化的免疫細胞群的組成，發現C57BL/6J乳岩癌小(xiǎo)鼠在經過不同劑量的AAV-MAEGI幹預後，高劑量組的小(xiǎo)鼠體(tǐ)内有(yǒu)着更高比例的CD4+和CD8+細胞，顯示了MAEGI療法可(kě)通過增強免疫反應來達到消除腫瘤的目的。
單細胞測序證實MAEGI療法對CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化作(zuò)用(yòng)
綜上所述，研究者證明了通過CRISPRa直接激活内源性突變基因可(kě)以放大腫瘤細胞的“非自身”信号，從而誘導強大的抗腫瘤适應性免疫。各種形式的MAEGI，包括AAV-g-MAEGI和AAV-p-MAEGI，以及任何内源性基因激活幹預的未來衍生物(wù)，提供了一種正交模态的腫瘤免疫幹預模式，即作(zuò)為(wèi)單一藥物(wù)或與其餘幹預模式協同使用(yòng)。在進入I期臨床試驗之前，MAEGI的未來臨床轉化還需要排除過表達的潛在有(yǒu)害基因，優化成分(fēn)和設計，在動物(wù)模型中(zhōng)評估毒性，以及開發成藥的探究性研究。
抗癌英雄免疫細胞
美國(guó)生物(wù)學(xué)家喬治戴利曾說：如果20世紀是藥物(wù)幹預時代，那麽21世紀就是細胞幹預的時代。在準确定位和識别癌細胞相關抗原的基礎上，人體(tǐ)的免疫系統會開始攻擊标記的癌細胞，其中(zhōng)殺傷性的免疫細胞作(zuò)為(wèi)尖兵構成了抗腫瘤免疫系統的重要力量，因此免疫細胞是抗癌戰役中(zhōng)的英雄。正常人體(tǐ)每天都将産(chǎn)生上百個癌變細胞，但它們在形成腫瘤病竈前就基本被免疫細胞消滅了。所以優質(zhì)的免疫系統是人體(tǐ)自身非常好的醫(yī)生。過繼性免疫幹預（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指從腫瘤患者體(tǐ)内分(fēn)離免疫細胞，在體(tǐ)外進行擴增和功能(néng)鑒定，然後向患者回輸，從而達到直接殺傷腫瘤或激發機體(tǐ)的免疫應答(dá)殺傷腫瘤細胞的目的。過繼性免疫細胞幹預主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等幾大類。其中(zhōng)CIK（cytokine-induced killer），又(yòu)稱為(wèi)多(duō)種細胞因子誘導的殺傷細胞，由于該種細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分(fēn)子，故又(yòu)被稱為(wèi)NK細胞樣T淋巴細胞，兼具(jù)有(yǒu)T淋巴細胞強大的抗瘤和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。因此，應用(yòng)CIK細胞被認為(wèi)是新(xīn)一代抗腫瘤過繼細胞免疫幹預的頭等方案。
CIK療法基本流程示意圖
CIK細胞中(zhōng)的效應細胞CD3+CD56+細胞在正常人外周血中(zhōng)極其罕見，僅1%～5%，在體(tǐ)外經多(duō)因子培養28～30天，CD3+CD56+細胞迅速增多(duō)，較培養前升幅可(kě)達1000倍以上，進而再回輸到體(tǐ)内，發揮響應的功能(néng)性，CIK主要有(yǒu)以下幾方面：
(1) CIK細胞增殖速度快，抗腫瘤細胞可(kě)大量增殖，且細胞功能(néng)也大大增強。(2) CIK細胞具(jù)有(yǒu)識别腫瘤的機制，對正常的細胞無毒性作(zuò)用(yòng)。(3) 殺瘤譜廣，可(kě)用(yòng)于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、腸癌等多(duō)種腫瘤的幹預，對多(duō)重耐藥腫瘤細胞同樣敏感。(4) 是典型的個性化生物(wù)幹預模式。将這類細胞回輸後，還能(néng)使機體(tǐ)免疫能(néng)力提高，産(chǎn)生特異的抗病菌作(zuò)用(yòng)，從而對腫瘤幹預施以雙重的作(zuò)用(yòng)。(5) 由于CIK細胞是活化的自體(tǐ)細胞。
人源胃癌細胞裸鼠模型的CIK免疫療法研究
然而免疫細胞也有(yǒu)質(zhì)量之分(fēn)，随着年齡的增長(cháng)，人體(tǐ)的免疫細胞也會發生相應的變化，其細胞活力及數量會随着年齡的增加而減弱。例如，人在40-50歲時，免疫細胞的功能(néng)（活力和數量）就僅為(wèi)身體(tǐ)年輕時期的1/2。這在一定概率上增加了人體(tǐ)的患病（如腫瘤等疾病）風險。為(wèi)避免這一問題，高端生物(wù)科(kē)技(jì )的細胞存儲技(jì )術應運而生，這種技(jì )術可(kě)以将細胞存儲一定的時期，其功能(néng)不受因時間推移産(chǎn)生明顯的影響。如果能(néng)将人體(tǐ)年輕時的優質(zhì)免疫細胞進行存儲，在需要時提取使用(yòng)，無疑對于抗感染、抗腫瘤及提高自身免疫力等方面都有(yǒu)很(hěn)大的幫助。
免疫細胞存儲—您的“健康種子”
免疫細胞存儲是指利用(yòng)先進的生物(wù)技(jì )術，從人體(tǐ)血液中(zhōng)分(fēn)離并富集一定數量的免疫細胞，結合細胞的生物(wù)物(wù)理(lǐ)因素，将免疫細胞保存在-196℃的低溫條件下，從而維持免疫細胞的多(duō)樣性與高潛能(néng)，使細胞處于休眠狀态，待需要時再進行複蘇和擴增，用(yòng)于準确細胞幹預和美容抗衰老等領域。具(jù)體(tǐ)來說就是利用(yòng)特定的細胞凍存基質(zhì)，這些基質(zhì)通常含有(yǒu)冷凍保護劑DMSO或者甘油以及血清組分(fēn)，并通過緩慢的梯度降溫曆經4℃、-20℃、-80℃并會達到-196℃，也可(kě)通過商(shāng)業化的細胞凍存盒将細胞直接放入-80℃并進而放入液氮中(zhōng)。細胞複蘇則強調的是快速，即将液氮中(zhōng)的細胞直接放入37℃進行水浴，快速升溫減少細胞複蘇過程中(zhōng)冰晶等融化帶來的傷害，通過慢凍存快複蘇可(kě)以減少細胞的受損程度，維持細胞的功能(néng)性。
細胞存儲的目的是為(wèi)了将來使用(yòng)，無論是防病、治病還是抗衰老，都對存儲細胞的機構的科(kē)研能(néng)力和存儲能(néng)力有(yǒu)很(hěn)高的要求。在國(guó)内相關的企業中(zhōng)，吉濤健康與中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院在近日簽署了免疫細胞科(kē)研戰略合作(zuò)協議。雄厚的科(kē)研實力和專業的市場化管理(lǐ)，讓雙方的合作(zuò)在細胞存儲、制備及科(kē)研轉化等方面形成了四位一體(tǐ)的細胞全流程服務(wù)鏈條。中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院種子庫凍存細胞的服務(wù)更為(wèi)吉濤生物(wù)的用(yòng)戶打造了多(duō)點備災的保險櫃，可(kě)為(wèi)用(yòng)戶終身存儲細胞。
